免疫組化、免疫印跡對比分享

一、原理差異

免疫組化：融合了免疫學(xué)原理（抗原抗體特異性結合）和組織學(xué)技術(shù)（組織的取材、固定、包埋、切片、脫蠟、水化等），通過(guò)化學(xué)反應使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色，來(lái)對組織（細胞）內抗原(多肽和蛋白質(zhì))進(jìn)行定位、定性及相對定量的研究(主要是定位)。樣本是細胞或組織，稱(chēng)為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。要在顯微鏡下觀(guān)察結果，可能出現膜陽(yáng)性、質(zhì)陽(yáng)性和核陽(yáng)性。

免疫印跡（immunoblotting）又稱(chēng)蛋白質(zhì)印跡（Western blotting），是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。先要進(jìn)行SDS-PAGE，然后將分離開(kāi)的蛋白質(zhì)樣品用電轉儀轉移到固相載體上，而后利用抗原-抗體-標記物顯色來(lái)檢測樣品，可以用于定性和半定量。結合化學(xué)發(fā)光檢測，可以同時(shí)比較多個(gè)樣品同種蛋白的表達量差異。

二、實(shí)驗目的

免疫組化 IHC / IF / ICC ——蛋白定位檢測分析

1.定位較直接準確

2.定性靈敏度高

3.半定量（高質(zhì)量染色，背景淺，特異性強的切片；表達量較多的蛋白）

免疫印跡試驗 Western blot

1.測樣品內蛋白含量，定量較IHC更準確

2.定性和間接定位，敏感性遠遠低于免疫組化技術(shù)

三、實(shí)驗準備

（一）免疫組化實(shí)驗樣本
（新鮮，固定方式，充分脫水，防脫處理）

1.取材新鮮，及時(shí)固定：防止離體太久而發(fā)生組織自溶長(cháng)菌，抗原擴散或丟失，易保存

2.固定液：

（1）醛類(lèi)：形態(tài)結構保存好，穿透性強，組織收縮少；醛基與蛋白氨基交聯(lián)形成羧甲基，使抗原決定簇不能充分暴露，需要抗原修復

- 4%多聚甲醛（常用，適用大多數組織，細胞）

- 10%福爾馬林/甲醛（常用，脂肪類(lèi)，脊髓類(lèi)）

-戊 二 quan（微細結構保存好，用于電鏡）

（2）醇類(lèi)：穿透性強，脫水性強，易引起組織收縮，使蛋白變性作用輕，抗原可流失。

-乙醇，甲醇

（3）其他固定劑

-丙酮，抗原保存性好，脫色性更強，常用于部分細胞爬片

-混合固定劑，Bouni 液，Zamboni液，AAF液等

固定時(shí)間：醛類(lèi)建議24小時(shí)以?xún)?，醇?lèi)，丙酮2小時(shí)以?xún)?，組織大小厚度略有差異

3. 充分脫水：保存時(shí)間長(cháng)，防止裂片，保持組織結構，防止冰切形成冰晶

4. 防脫處理：防止掉片，多聚賴(lài)氨酸防脫切片，明膠和硫酸鉻鉀處理等

免疫組化切片類(lèi)型

1.石蠟切片

易保存（干燥低溫4~8℃保存），厚度3~6um，結構形態(tài)好，需要抗原修復，抗原活性偏低（烤片，固定等）

2.冰凍切片

不易保存（-80℃保存半年），厚度10~20um，形態(tài)結構較差，抗原活性高，不一定抗原修復，胞內核內抗原需打孔

冰凍切片是否需要抗原修復？如何固定？

（1）不能及時(shí)切片染色觀(guān)察：可選擇固定（24小時(shí)內）后切片，需要修復；或馬上包埋切片后固定（10 min以?xún)龋?，可修復可不修?/span>

（2）馬上切片染色觀(guān)察的，可不固定，可不修復

3.細胞爬片（貼壁，半貼壁，懸?。?/span>

單層細胞，均勻爬片，選擇合適的固定方式保證細胞形態(tài)，細胞周期同一化，不需要修復---培養皿/平板 ---蓋玻片爬片

（二）實(shí)驗準備-WB實(shí)驗樣本

1.新鮮制備，低溫 裂解 （全蛋白，不包括核抽提、亞細胞器分離等）

2.裂解液，蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑

3.研磨（組織），液氮（小體積組織），超聲波（細菌/細胞）

4.跑膠，蛋白定量

注意事項：

1.防止蛋白降解，磷酸化蛋白防止去磷酸化

2.濃度低蛋白量少不易檢測，濃度高裂解液粘稠不易吸取

3.分泌型蛋白，無(wú)血清細胞培養收集上清，TCA沉淀富集