Western Blot 常見問題及解決方案

一、背景過高

原因：

封閉不充分；一抗過濃；孵育溫度過高；一抗二抗封閉劑間有交叉反應；洗膜不充分；膜過于干燥

方案：

延長封閉時間或更換封劑；稀釋一抗；4℃孵育；加入Tween-20，以減少交叉反應；設二抗對照，稀釋二抗；增加洗膜次數；避免干膜

二、無條帶或太弱

原因：

一抗二抗選擇錯誤；一抗二抗濃度過低；一抗失效；蛋白含量過低；轉膜不充分或洗膜過度；過度封閉；二抗受疊氛鈉抑制；底物與酶失效；曝光時間過短

方案：

選擇正確抗體；檢查抗體和顯色試劑盒保質期；提高樣品蛋白含量；設內參對照，轉膜對照；轉膜效果的檢查；減少洗膜時間

降低封閉液濃度，減少封閉時間；延長曝光時間

三、雜帶過多

原因：

蛋白樣本具有多種修飾；蛋白樣本降解；蛋白存在二聚體或多聚體；一抗二抗濃度過高；多克隆抗體

方案：

使用去修飾的試劑；使用蛋白酶抑制劑；電泳上樣前，煮沸10 min，以增強蛋白質解聚變性；降低抗體濃度；選用單克隆抗體

四、其他問題

1.背景白色條帶 → 轉膜時有氣泡或抗體分布不均

2.暗片現白條帶 → 一抗或二抗加入過多

3.目的條帶過低/過高 → 膠濃度不合適

4.“微笑"條帶 → 遷移過快、電泳溫度過高