優(yōu)化ELISA的技巧

更新時(shí)間：2025-02-10

瀏覽次數：328

1. 選擇合適的ELISA格式

由于ELISA的設計非常靈活，因此可以根據實(shí)驗需求進(jìn)行合適的格式選擇。最好使用簡(jiǎn)單的ELISA格式，這樣對成本控制更有利；但是同樣的，還需要考慮特異性、干擾等問(wèn)題。例如，如果是篩選合適的單抗，那么簡(jiǎn)單的直接或間接ELISA比較合適；如果是在復雜基質(zhì)中特異性檢測目標待測物時(shí)，則夾心ELISA是好的選擇。如果是檢測一些分子量較小，同時(shí)關(guān)鍵試劑不好獲得時(shí)，競爭ELISA則是更好的選擇。

2. 選擇合適的包被表面（板）

由聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的平底96孔板用于絕大多數ELISA分析。使用專(zhuān)為ELISA設計的板非常重要，因為它們的制造是為了保持一致性、最大限度地減少邊緣效應并為數據收集提供最佳光學(xué)條件。最好選擇值得信賴(lài)的廠(chǎng)家，或對于一些耗材提供商的產(chǎn)品進(jìn)行產(chǎn)品性能確認，通過(guò)對同意樣品標準化操作，然后比較批內和批間各個(gè)孔的信號差異，盡量控制到5%以下。

值得注意的是，一些酶法在催化底物時(shí)，產(chǎn)生的是熒光或者化學(xué)信號，這時(shí)候可能需要選擇一些不透明的板，防止熒光透射到其它孔徑中干擾檢測。

除了考慮到均一性等性能外，還要考慮板的包被載量和結合特性。

關(guān)于結合特性，可能是在包被一些特殊蛋白時(shí)需考量。如：因通常ELISA包被是利用疏水作用等物理特性包被的，當需要包被的蛋白太小且大部分氨基酸都是親水氨基酸時(shí)，常規的包被方式就不合適，這時(shí)候其實(shí)也可以更管合適的ELISA板，如處理后的親水表面ELISA板。

3. 選擇合適的包被方式

選擇合適的包被方式包被主要要考慮的是包被液、溫度、濃度、時(shí)間等條件。常見(jiàn)的包被液有碳酸鹽緩沖液（CBS）和磷酸鹽緩沖液（PBS）。CBS pH值在9.6左右，呈弱堿性；PBS pH值在7.4左右，偏中性。包被的蛋白可能會(huì )因為一些氨基酸、等電點(diǎn)的原因，導致在堿性條件下包被不理想，可以嘗試不同類(lèi)型的包被液。

包被溫度一般有4℃、室溫、37℃等條件。一般包被溫度和包被時(shí)間相配合。一般包被4℃和室溫都是過(guò)夜包被，而37℃通常2小時(shí)左右就可以了。但是一般4℃和室溫過(guò)夜包被更加穩定充分，且對蛋白保護較好，37℃可能一些蛋白不太穩定，包被均一性可能也有些不確定，在條件允許下，推薦過(guò)夜包被。包被濃度的選擇一般和板載量和測量格式的適配程度相關(guān)，一般通過(guò)棋盤(pán)進(jìn)行確認和選擇，將會(huì )在棋盤(pán)條目進(jìn)行闡述。值得注意的是，一些小蛋白如多肽很難包被，這是可選擇對其進(jìn)行蛋白偶聯(lián)，常見(jiàn)的偶聯(lián)物有BSA、KLH、OVA等。

4. 選擇合適的封閉液

封閉液的選擇關(guān)乎到ELISA的整體性能，封閉的目的是包被完成后，將空白位置填補上，防止后續步驟中的任何非目標結合的蛋白結合到板子上，造成干擾和背景信號異常。通常的封閉液都是一些無(wú)關(guān)蛋白，如BSA、動(dòng)物血清、脫脂奶粉、酪蛋白等。目前也有一些針對特殊需求的非蛋白封閉劑。當你在進(jìn)行ELISA檢測無(wú)論如何進(jìn)行試劑濃度調整，發(fā)現背景信號都很異常時(shí)，可能就是封閉液選擇不對，就需要分析可能的原因。如封閉液BSA較大，在一些特殊條件下可能不能填補非特異結合的無(wú)關(guān)蛋白的結合位置，這時(shí)候就需要更換成酪蛋白等較小的封閉試劑等。